Risposte anticorpali preferenziali di coniglio contro C

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 9156 (2023) Citare questo articolo

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Gli anticorpi prodotti nei conigli immunizzati con peptidi sono stati utilizzati nella ricerca biologica per decenni. Sebbene vi sia stata un’ampia implementazione di questo approccio, a volte è difficile colpire proteine ​​specifiche per molteplici ragioni. Una considerazione che è stata notata nei topi è che le risposte umorali possono avere come bersaglio preferenziale il terminale carbossilico della sequenza peptidica che non è presente nella proteina intatta. Per far luce sulla frequenza delle risposte anticorpali preferenziali di coniglio ai C-terminali degli immunogeni peptidici, presentiamo la nostra esperienza con la generazione di anticorpi di coniglio contro NOTCH3 umano. Sono stati prodotti un totale di 23 anticorpi contro 10 sequenze peptidiche di NOTCH3 umano. È stato determinato che oltre il 70% (16 su 23) di questi anticorpi policlonali erano C-terminali preferendo: Gli anticorpi reattivi al peptide NOTCH3 miravano in gran parte al gruppo carbossilico libero terminale del peptide immunizzante. Gli anticorpi che preferivano gli epitopi C-terminali reagivano debolmente o non reagivano affatto con sequenze bersaglio ricombinanti con estensione C-terminale che eliminava il gruppo carbossilico libero della struttura immunogena; inoltre, ciascuno di questi antisieri non ha rivelato alcuna reattività anticorpale verso le proteine ​​troncate prima del C-terminale dell'immunogeno. Nelle applicazioni immunocitochimiche di questi anticorpi anti-peptidi, abbiamo riscontrato similmente reattività verso bersagli ricombinanti che si legano meglio alle cellule che esprimono il C-terminale libero della sequenza immunizzante. Nel complesso, la nostra esperienza dimostra una forte propensione per i conigli a montare risposte anticorpali agli epitopi C-terminali dei peptidi derivati ​​da NOTCH3, che si prevede ne limiti l'uso contro la proteina nativa. Discutiamo alcuni potenziali approcci per superare questo pregiudizio che potrebbero migliorare l'efficienza della generazione di anticorpi in questo paradigma sperimentale comunemente utilizzato.

Lo sviluppo e l'applicazione degli anticorpi di ricerca sono stati indispensabili per lo studio delle proteine. Tra gli anticorpi di ricerca, gli antisieri anti-peptidi hanno ottenuto un notevole favore, in gran parte grazie alla delucidazione di un gran numero di sequenze genetiche codificanti proteine ​​e ai progressi tecnologici nella sintesi dei peptidi. Questi progressi consentono di produrre antisieri, solitamente senza difficoltà, immunizzando animali senza la necessità di produrre o purificare target proteici1,2.

Nonostante il grande successo, l'immunizzazione anti-peptidica talvolta non riesce a generare anticorpi utili per il rilevamento dei bersagli proteici1,3. Gli insuccessi sono stati attribuiti all'incapacità dell'antigene peptidico di adottare la stessa conformazione della proteina bersaglio4, al seppellimento della sequenza bersaglio in regioni inaccessibili5 o alla modificazione post-traduzionale della proteina bersaglio che non si riflette nell'immunogeno peptidico.

In uno studio precedente, Liang e colleghi6 hanno notato un'altra potenziale ragione per la mancata generazione di anticorpi anti-peptidi utilizzabili: il targeting preferenziale degli anticorpi contro il carbossiterminale (C-terminale) dei peptidi immunizzanti che non è presente nella proteina intatta. Hanno riferito che l’immunizzazione di topi con un epitopo interno di C-CAM1 ha prodotto una risposta anticorpale in gran parte all’estremità C-terminale del peptide immunizzante; gli anticorpi monoclonali dei topi reagivano al peptide immunizzante in modo dipendente dal terminale C dell'immunogeno, ma questi anticorpi non si legavano alla proteina intatta. I ricercatori hanno concluso che gli anticorpi monoclonali derivati ​​dal topo richiedevano la porzione carbossilato presente nella porzione C-terminale che veniva eliminata dal legame peptidico presente nella proteina intatta.

In un altro studio, Edwards e colleghi7 hanno sviluppato un approccio efficace per generare anticorpi contro le proteine ​​batteriche che si basava sull’immunizzazione dei conigli con piccoli peptidi corrispondenti ai terminali C delle singole proteine. Questo studio ha indicato che i conigli erano in grado di generare risposte efficaci ai C-terminali dei peptidi e che gli antisieri generati per gli immunogeni corti erano notevolmente specifici. La proporzione relativa di anticorpi che preferivano il C-terminale degli immunogeni peptidici era elevata per diversi anticorpi riportati, come valutato mediante competizione peptidica dei test ELISA.